一、对象

　　共收集骨髓20例，男性15例，女性5例，年龄2～19岁，中位年龄9.35岁。其中急性淋巴白血病（ALL）17例（B-ALL 13例，T-ALL 4例），急性髓性白血病（AML）3例（M2 2例，M5 1例）。20例中初治患者7例，持续完全缓解11例，确诊复发者2例。所有患者均为广州医学院第一附属医院儿科住院病例。

　　二、实验方法

　　通过Ficoll-Hypaque梯度密度离心法分离出白血病儿童骨髓单个核细胞，贴壁法体外纯化扩增MSCs，获得第3～4（P3~4）代细胞用于实验。光镜观察细胞生长形态，瑞氏染色观察细胞核浆比例及形态，MTT法检测细胞增殖，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测免疫表型，油红O染色及茜素红染色检测其向脂肪及骨细胞分化等观察其生物学特性。取外周血单个核细胞（Peripheralblood mononuclear cells，PB-MNCs），用植物凝集素（PHA）及白细胞介素2（IL-2）进行刺激后将MSCs按照不同比例（1/5~1/1000）加入MNCs中，进行细胞相互接触的共培养、transwell体系的细胞非接触性共培养，在培养第5天后收集悬浮细胞，用LDH法检测各组中MNCs的增殖情况，用ELISA方法检测单独MNCs、加入不同比例的MSCs与MNCs接触共培养体系中各组干扰素-γ（IFN-γ）和穿孔素（perforin）的分泌情况，再用流式细胞术分析单独MNCs、不同比例MSCs∶MNCs接触共培养体系中T细胞亚群CD3、CD4、CD8及调节性T细胞CD4、CD25的免疫表型表达情况。

　　三、结果

　　3.1 MSCs形态学特点

　　原代的MSCs纯度不理想，形态差异比较大。随着传代代数的增加，细胞形态逐渐均匀一致。MSCs细胞体积较大，形态上呈梭形，胞浆丰富，核偏大。如图2。

　　图2（A）                    （B）

　　A：细胞胞浆丰富，核染色质细，细胞核偏大。（×400）

　　B：细胞贴壁呈长梭形，P3代以后的MSCs形态较均一。（×200）

　　3.2生长曲线

　　MSCs生长速度因骨髓来源的年龄、病程及类型不同具有个体差异，但是大部分MSCs生长曲线呈现：细胞传代后3d内处于潜伏期，3d后进入生长期， 8d后进入平台期。如图3所示。

　　图3 P1、P3代MSCs生长曲线

　　3.3多向分化的鉴定

　　MSCs经成脂诱导后7天左右，部分细胞胞质内出现散在小脂滴，主要分布细胞核周围。脂滴随着时间的延长而增多，继续诱导可见脂滴逐渐融合成大脂滴，细胞核被大颗粒状的脂滴挤向一侧（图5 A）。成骨诱导第7天可见少量的钙盐分泌物沉积，12 d后见多量钙盐分泌物沉积，茜素红染色显示茜素S与钙盐结合成红色，成骨诱导成功（图5B）。

　　图5（A）                      图5（B）

　　3.4冻存后复苏

　　冻存后复苏的间充质干细胞活细胞率达90%，且可以继续传代，生物学特性和未冻存细胞差异不显著。

　　四、讨论及结论

　　本实验能够成功培养出白血病儿童骨髓来源的MSCs，且综上所述认为MSCs可能有潜在促进免疫重建及抗白血病的能力，所以，白血病患儿接受化疗后，进行输注自体MSCs具有可行性。由于化疗剂量和强度的限制和LSC的存在，不少白血病患者经过长期规则的化疗后体内仍然残留有微量的白血病细胞，是白血病复发的主要原因。综上所述，我们认为白血病儿童骨髓来源的MSCs对免疫细胞的调节作用具有两面性，在一定条件下，具有促进白血病儿童化疗期间的骨髓造血功能和免疫功能恢复的作用，MSCs有望通过免疫调节也参与到细胞免疫治疗当中，促进免疫功能重建和提高免疫细胞识别和攻击白血病细胞的作用，达到肿瘤免疫治疗的目标，在肿瘤免疫治疗上具有其应有的地位，作用机理也有待更深入的研究。

　　参考文献

　　1.杨桂玲，岳军峰，等自体骨髓间充质干细胞输注支持长期反复化疗急性白血病的疗效观察[J]实用临床医学。2008年第7期

　　2.黄科，周敦，黄绍良等。不同年龄段人骨髓间充质干细胞生物学特性的研究。[J]中国实验血液学杂志，2005.P.1049-1053

　　3.周晓宏童春容等。自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗急性B淋巴细胞白血病22例临床观察。[J]河北医学。2003年4月